Com mais de 400 publicações em diferentes áreas, a PCR digital é uma evolução das técnicas de PCR, que permite uma quantificação absoluta, altamente sensível de ácidos nucleicos sem a necessidade de curva padrão. No sistema de PCR Digital da Bio-Rad, uma amostra é dividida em 20.000 gotas que após a amplificação, as gotas contendo a sequência alvo são detectadas por fluorescência e classificadas como positivas e gotas sem fluorescência são negativas.
Como a PCR digital funciona?
A PCR digital melhora a sensibilidade da qPCR e permite a detecção de eventos raros, tais como: mutações de um único nucleótido numa população de sequências de tipo selvagem. Na qPCR, o sinal de sequências de tipo selvagem pode dominar e obscurecer o sinal da sequência rara. Ao minimizar os efeitos da competição entre alvos, a PCR Digital supera as dificuldades inerentes à amplificação de sequências raras, permitindo a quantificação absoluta sensível e precisa de ácidos nucleicos.
Um passo crítico na PCR digital é o particionamento da amostra. A amostra é preparada de uma forma semelhante à PCR em Tempo Real, mas é então separada em milhares de partições, cada uma contendo idealmente zero ou uma (ou, no máximo, algumas) moléculas molde. Cada partição comporta-se como uma reação de PCR individual e, tal como a PCR em Tempo Real, são utilizadas sondas fluorescentes para identificar o DNA alvo amplificado. Cada partição pode então ser prontamente analisada após amplificação para determinar se contém ou não a sequência alvo. As amostras contendo produto amplificado são consideradas positivas (1, fluorescentes), e as que não têm produto, e portanto com pouca ou nenhuma fluorescência, são negativas (0). A proporção de positivos para negativos em cada amostra é a base da quantificação. Ao contrário da qPCR, a PCR Digital não depende do número de ciclos de amplificação para determinar a quantidade inicial de ácido nucleico em cada amostra; Em vez disso, baseia-se no cálculo estatístico de Poisson para determinar a quantidade absoluta de DNA.
O passo de particionamento da amostra de PCR Digital, associado à análise de dados estatísticos de Poisson, permite maior precisão que os métodos tradicionais de PCR e qPCR. A PCR Digital é bem adequada para aplicações que requerem detecção de pequenas quantidades de ácido nucleico ou uma resolução precisa da quantidade de DNA alvo entre amostras, por exemplo, detecção de sequências raras e análise de variação de número de cópias (CNV).
Aplicações da PCR digital
A PCR Digital melhora a sensibilidade da qPCR e permite a detecção de eventos raros, pois minimiza os efeitos da concorrência entre os alvos, superando as dificuldades inerentes à amplificação de sequências raras e permite uma quantificação absoluta, sensível e precisa.
A PCR Digital apresenta vantagens significativas em relação a outros métodos de PCR, como quantificação absoluta e sensibilidade muito maior. Devido à alta sensibilidade, precisão e capacidade de quantificação, a PCR Digital atinge um alcance maior nas análise de ácidos nucleicos quando comparada a outros métodos, em uma série de aplicações:
– Biópsia Líquida
– Variação do número de cópias (CNV)
– Detecção de sequências raras
– Análise de expressão gênica e miRNA
– Análise de single cell
– Detecção de patógenos
– Validação de biblioteca de NGS (next generation sequencing)
Biópsia líquida
Biópsia líquida é um exame não invasivo capaz de detectar células cancerosas (células circulantes de tumor, CTC) ou DNA liberado a partir de tumores (DNA de tumor, ctDNA circulantes) no sangue. Está sendo cada vez mais utilizada para detecção e acompanhamento do câncer. Ao contrário de biópsias de tecidos tumorais, a biópsia líquida apresenta risco mínimo para a pessoa e pode ser facilmente repetida ao longo do tempo para fins de diagnóstico, quantificação da doença e monitoramento do seu progresso.
O ctDNA e CTC estão presentes em níveis muito baixos, a PCR Digital é capaz de detectar com precisão e quantificar sequências raras na presença de alvos abundantes, dado o seu elevado nível de sensibilidade. Uma série de estudos tem mostrado que ddPCR pode ser utilizada com amostras de biópsia líquida, mais custo efetiva e muitas vezes com uma sensibilidade mais elevada do que outras técnicas.
Esta técnica é útil não só para a detecção de diferentes tipos de câncer, mas também pode ser utilizada para monitorar alterações em um câncer, detectar a heterogeneidade do tumor, encontrar biomarcadores e detectar a perda de resposta ao tratamento. A gama de doenças que pode ser detectada e rastreada por biópsia líquida está se expandindo rapidamente. Alguns exemplos incluem a detecção precoce de diabetes tipo 1, detecção e monitoramento de infecções, transplante de órgãos e testes de gravidez não-invasivos.
Detecção de mutações raras
A detecção precisa de sequências raras de ácidos nucleicos em amostras com background representa um desafio para os ensaios de PCR tradicionais. A relação sinal/ruído em amostras de PCR pode dificultar tanto a detecção quanto a interpretação de dados para alvos de baixa abundância.
Por exemplo, tem sido demonstrado na análise de microbiomas que os organismos altamente abundantes são mais representados em ensaios de PCR em Tempo Real padrão, enquanto as espécies de baixa abundância estão sub-representadas.
No sistema ddPCR, após a amostra ser dividida em milhares de gotículas, uma sequência rara estará presente apenas em algumas das gotículas em que haverá idealmente poucas ou nenhuma sequência concorrente. A partição de sequências raras longe do conjunto total de sequências de alta abundância, facilita a sua amplificação e subsequente detecção, proporcionando uma estimativa mais precisa da sua representação dentro de uma amostra.
A PCR Digital permite maior desempenho na detecção e quantificação de sequências raras, porque a quantificação do alvo é independente do número de ciclos de amplificação. A expansão da PCR Digital para detecção de sequências raras inclui:
– Detecção de câncer abaixo do nível detectável por testes atuais
– Monitoramento de novas mutações e duplicações no câncer quando elas surgem
– Detecção de cargas virais, como o HIV, abaixo dos valores detectáveis por testes atuais
– Os testes não invasivos em fluidos corporais (biópsia líquida) para doenças infecciosas e câncer, incluindo o DNA livre circulante (cfDNA)
– Testes pré-natais não invasivos utilizando o cfDNA
– Detecção de rejeição de transplante em DNA circulante
Detecção de mutações raras em doenças infecciosas
Os tratamentos atuais podem reduzir a carga viral para níveis que não são detectáveis de forma reprodutível pelos testes de diagnóstico atuais. O aumento da sensibilidade da PCR Digital combinada com a quantificação absoluta proporciona a capacidade de medir e monitorar cargas virais muito baixas. Em um relatório recente, o ddPCR foi usado para testar a carga residual de HIV-DNA no caso de uma criança que foi finalmente considerada “curada” da infecção. Com o potencial para curar pacientes HIV, há uma necessidade urgente de determinar se a cura é real, ou se os baixos níveis de vírus latente permanecem.
Detecção de mutações raras em câncer
Alta sensibilidade é necessária para detectar a presença de câncer residual, estágios iniciais de recorrência após a remissão e novas mutações que possam surgir.
Aumento da sensibilidade ao teste: na detecção de transcritos BCR-ABL na leucemia mieloide crônica, a PCR digital exibiu uma melhora de sensibilidade de 2-3 log em relação ao qPCR. Além disso, o ensaio de PCR Digital detectou transcritos BCR-ABL em vários pacientes classificados como negativos por PCR em Tempo Real. O ensaio de PCR Digital permitiu o monitoramento contínuo do declínio nos níveis de transcrição depois que eles se tornaram indetectáveis por PCR em tempo real. Em um artigo recente do Dr. Jennings, determinou-se que o LOD (limite de detecção) para o transcrito BCR-ABL utilizando a ddPCR era tão baixo quanto 0,0001% (0,001% para o LOQ (limite de quantificação).
Detecção de novas mutações e duplicações: células cancerígenas são geneticamente instáveis, com aparecimento de novas mutações e eventos de duplicação que surgem frequentemente. Fazer a detecção de mutações a medida que vão surgindo, ajuda a adaptação do tratamento a essas mudanças, sendo um dos principais objetivos do diagnóstico e tratamento do câncer.
No câncer de pulmão de células não pequenas, com mutações ativadoras no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) respondem geralmente bem ao tratamento com inibidores da tirosina quinase. No entanto, as recidivas são frequentemente observadas após o tratamento devido a uma segunda mutação adquirida de resistência. O sistema ddPCR foi utilizado para analisar tanto a ativação de mutações de EGFR como a aquisição de mutação de resistência. Os resultados demonstraram que o sistema ddPCR permite a detecção precoce de uma falha do tratamento inicial com inibidores de tirosina quinase e mostra potencial para monitorar a progressão da doença e orientar o tratamento.
Testes pré-natal não invasivos
A análise de cfDNA fornece uma opção não invasiva para o teste pré-natal. De 3 a 13% do total de cfDNA no plasma de mulheres grávidas é geralmente DNA fetal. Novas técnicas, incluindo a sequenciamento de nova geração, permitiram a detecção de anomalias genômicas fetais no total de cDNA materno.
Os testes de aneuploidia dos cromossomos 13, 18 e 21 estão atualmente aprovados para uso clínico. A PCR digital foi usada para a avaliação de risco pré-natal para a síndrome de Down pela detecção da trissomia 21 em cDNA no plasma materno e RNA. Estudos recentes demonstraram que a análise de ddPCR do cDNA fetal pode ser usada para a avaliação de risco de outras doenças comuns, como anemia falciforme e hemofilia. Em um artigo recente, sobre o uso do QX200™ Droplet Digital™ PCR System para o diagnóstico pré-natal não invasivo (NIPD) da acidemia metilmalônica, uma doença metabólica hereditária, eles concluem que o ddPCR é uma abordagem econômica e não invasiva para diagnosticar mutações conhecidas relacionadas a distúrbios mendelianos no feto.
Visite a página da Bio-Rad para ler mais sobre a PCR Digital e obter as referências bibliográficas.
Para mais informações:
4003 0399 (Capitais e Regiões Metropolitanas)
0800 200 8900 (Demais Localidades)
Atendimento ao Cliente: atendimento@bio-rad.com
Suporte Técnico: suportecientifico@bio-rad.com
Fonte: LabNetwork
