A terapia genética está preparada para se tornar o próximo grande desenvolvimento na medicina e trazer alívio para pacientes que vivem com doenças que vão desde a hemofilia até a doença de Alzheimer, escrevem Mark White, Diretor Associado de Marketing de Produtos Biofarmacêuticos, e Marwan Alsarraj, Gerente do Segmento Biofarmacêutico da Bio-Rad.
Mais de quatrocentos testes de terapia genética estão ativos ou recrutando nos EUA no momento.1 No entanto, conforme evidenciado por décadas de pesquisa, o desenvolvimento da terapia genética é cercado de desafios, como produzir doses que contenham a concentração correta de cópias de genes saudáveis, o que determina a potência da dose.
O vírus adeno-associado é a principal forma de entrega de genes saudáveis as células, mas a quantidade de AAV não é fácil de ser medida com precisão, o que cria incerteza na concentração do genoma do vetor e, por sua vez, na segurança e eficácia de cada dose.
Os AAVs são os vetores mais comuns usados em terapias genéticas porque são portadores naturalmente seguros e eficazes de informação genética. Eles não causam doenças em humanos, expressam persistentemente transgenes em células que não se dividem, possuem um baixo perfil imunológico, pois apenas provocam uma resposta imune limitada e, em alguns casos, também direcionam o sistema imunológico para tolerar produtos transgênicos.2
Apesar dessas vantagens, o desenvolvimento de AAV envolve obstáculos para os fabricantes e o mais relevante deles é produzir vetores funcionais em altas concentrações.
Após o bioprocessamento upstream dos vetores AAV, a concentração do vetor pode chegar a 2 x 1011 genomas do vetor/mL, mas ela não é suficiente para criar uma dose em um volume razoável para uso em pacientes.3
As terapias genéticas dirigidas ao fígado, como aquelas para hemofilia B, por exemplo, devem ser administradas em uma dose de 1012 genomas vetoriais/kg. Enquanto isso, terapias direcionadas a regiões mais complexas, como o sistema nervoso central (para condições como a doença de Alzheimer), devem ser administradas em uma concentração mais alta, de 1014 vetores/kg, para reduzir o volume da dose.3
Para fornecer doses eficazes para essas e outras condições em um volume razoável, os desenvolvedores devem concentrar seus vetores de AAV de 100 a 10.000 vezes.4 Essa discrepância exige uma quantificação precisa de AAV após as etapas de purificação e concentração para garantir que seu produto final contenha a dose correta do vetor.
O método mais comum usado para medir o título de AAV quantifica os genomas do vetor através da PCR em Tempo Real (qPCR).
Embora adequada para muitas aplicações, a qPCR não é precisa o suficiente para garantir aos fabricantes a potência de seus lotes de AAV, porque depende de uma medida relativa: para determinar o título de AAV usando qPCR, é necessário comparar os resultados obtidos com uma curva padrão.
As curvas padrão são preparadas usando um material de referência, geralmente DNA de plasmídeo, mas esses padrões de referência nem sempre são confiáveis.
Por exemplo, o DNA do plasmídeo de referência pode formar estruturas secundárias que afetam os resultados da qPCR. O primer pode ter dificuldade para se ligar ao padrão de referência, o que dificulta a amplificação e produz uma superestimação do título viral.2
Além disso, um estudo descobriu que a qPCR calculava títulos diferentes, dependendo da região do gene de referência em que o primer se ligava.5
Quantificando AAV com PCR Digital em Gotas
Para superar essas limitações, a Dra. Birei Futura-Hanawa e sua equipe no Instituto Nacional de Ciências da Saúde no Japão desenvolveram um ensaio de PCR digital (ddPCR) de gota bidimensional (2D) que quantifica o título de AAV sem uma curva padrão.
A ddPCR usa tecnologia de particionamento para quantificar sequências de ácidos nucleicos. O método começa carregando 20 μL de mix de reação em cartuchos. Em seguida, ela é dividida em aproximadamente 20.000 gotas uniformes de 1 nL, cada uma contendo não mais do que algumas cópias de ácido nucleico.
Uma reação de PCR individual ocorre em cada gota. À medida que o DNA amplifica, as sondas específicas da sequência são clivadas e liberam um sinal fluorescente que ilumina a gota.
Os fabricantes de AAV usam primers específicos para esse vetor, portanto, à medida que a reação ocorre, apenas essa sequência será amplificada. Isso significa que as gotas que contêm o genoma do AAV emitirão um forte sinal fluorescente, enquanto as gotas que não contêm o genoma do AAV emitirão apenas uma fluorescência fraca.
Após a etapa de PCR, uma leitora digital conta o número de gotas fluorescentes e não fluorescentes. Usando estatísticas de Poisson, o software calcula automaticamente o título de AAV na amostra original.
Como a ddPCR não depende de uma curva padrão, ela não está sujeita a erros de calibração. Além disso, o Dr. Futura-Hanawa descobriu que a ddPCR é menos susceptível a estruturas secundárias no DNA alvo do que a qPCR.2
Medindo a integridade e a atividade do vetor
Outro fator que pode afetar a potência de um tratamento é a proporção de vetores totalmente funcionais no lote. A concentração do genoma viral e a concentração do genoma infeccioso podem diferir, às vezes devido a imprecisões na forma como os genomas virais são contados.6,7
Um ensaio, por exemplo, pode detectar produtos de degradação formados durante a purificação e extração do genoma, DNA contaminante ou genomas vetoriais truncados.
Se um ensaio detectar essas sequências genômicas não funcionais, poderá superestimar a concentração de vetores ativos e levar um fabricante a produzir uma terapia insuficientemente potente.
A ddPCR não apenas oferece uma medida mais precisa do título viral do que a qPCR, mas pode inclusive medir a integridade do AAV e prever sua atividade no corpo.
O ensaio de ddPCR 2D do Dr Futura-Hanawa detecta se os genomas do vetor estão completos usando duas sondas que se ligam a duas regiões distantes do genoma do vetor AAV. Usando essa técnica, foi possível descobrir que o lote de vetores continha aproximadamente 40% de genomas incompletos.2
Além disso, foi constatado que o ensaio de ddPCR 2D de sua equipe poderia ser usado para prever a atividade do vetor no corpo, quantificando sua a degradação.
Depois de incubar os vetores à temperatura corporal, a equipe descobriu que a degradação, medida pela quantificação dos genomas dos vetores usando ddPCR, estava correlacionada com a atividade do vetor. Por outro lado, eles não encontraram nenhuma relação entre degradação e atividade quando quantificaram a degradação com qPCR.
O desenvolvimento futuro pode levar à produção de ensaios multiplex que examinam mais de duas regiões do genoma para aumentar ainda mais a precisão desse método e detectar genomas de vetores funcionais.
O futuro do desenvolvimento da terapia genética
As terapias genéticas não são fáceis de desenvolver. A indústria biofarmacêutica ainda tem muito a aprender sobre como esses produtos se formam no nível celular.
Enquanto isso, à medida que essas terapias estão sendo administradas aos pacientes, os desenvolvedores de AAV devem calcular a potência de suas terapias medindo o título de AAV com precisão e exatidão.
A ddPCR oferece uma solução confiável para desenvolvedores de terapias genéticas, pois fornece quantificação absoluta do título de AAV e pode prever a potência antes que um tratamento seja aplicado em um ser humano.
A incorporação da ddPCR no processo de controle de qualidade pode colaborar com o desenvolvimento da terapia genética com maior certeza e levar à produção de tratamentos mais seguros e eficazes.
Referências
- https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=%22gene+therapy%22&Search=Apply&recrs=b&recrs=a&recrs=d&age_v=&gndr=&type=&rslt=.
- B. Furuta-Hanawa, T. Yamaguchi and E. Uchida, “Two-Dimensional Droplet Digital PCR as a Tool for Titration and Integrity Evaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors,” Hum. Gene Ther. Methods 30(4), 127–136 (2019).
- www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/362178-Challenges-in-the-Downstream-Process-of-Gene-Therapy-Products.
- M. Hebben, “Downstream Bioprocessing of AAV Vectors: Industrial Challenges and Regulatory Requirements,” Cell & Gene Ther. Ins. 4(2), 131–46 (2018).
- F. Wang, et al., “A Reliable and Feasible qPCR Strategy for Titrating AAV Vectors,” Med. Sci. Monit. Basic Res. 19, 187–193 (2013).
- M. Lock, et al., “Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material,” Hum. Gene Ther. 21(10), 1273–1285 (2010).
- E. Ayuso, et al., “Manufacturing and Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 8 Reference Standard Material,” Hum. Gene Ther. 25(10), 977–987 (2014).
FONTE: Manufacturing Chemist
