Evolução das técnicas de PCR, a PCR Digital permite uma quantificação absoluta, altamente sensível de ácidos nucleicos sem a necessidade de curva padrão. No sistema de PCR Digital, uma amostra de PCR é dividida em 20.000 gotas que após a amplificação, as gotas contendo a sequência alvo são detectadas por fluorescência e classificadas como positivas e gotas sem fluorescência são negativas. Análise estatística entre o número de gotas positivas e negativas gera a quantificação absoluta da sequência do alvo.
Por que PCR Digital?
A PCR digital melhora a sensibilidade da qPCR e permite a detecção de eventos raros, pois minimiza os efeitos da concorrência entre os alvos, superando as dificuldades inerentes à amplificação de sequências raras e permite uma quantificação absoluta, sensível e precisa.
Muito útil, principalmente quando se trata de pequenas quantidades de ácido nucleico, como em amostras provenientes de biópsia líquida, variantes alélicas (SNPs), variação do número de cópias (CNV), monitoramente de mudanças sutis que não podem ser detectadas com PCR em tempo real.
A PCR Digital apresenta vantagens significativas em relação a outros métodos de PCR: quantificação absoluta e sensibilidade muito maior. Devido a alta sensibilidade, precisão e capacidade de quantificação, a PCR Digital atinge um alcance maior na análise de ácidos nucleicos quando comparada a outros métodos, em uma série de aplicações:
– Biópsia líquida;
– Variação do número de cópias (CNV);
– Detecção de sequências raras;
– Análise de expressão gênica e miRNA;
– Análise de single cell;
– Detecção de patógenos;
– Validação de biblioteca de NGS (next generation sequencing).
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Biópsia líquida
Biópsias líquidas são exames não invasivos que são capazes de detectar células cancerosas (células circulantes de tumor, CTC) ou DNA derramado a partir de tumores (ADN de tumor, ctDNA circulantes) no sangue. Está sendo cada vez mais utilizada para detecção e acompanhamento do câncer. Ao contrário de biópsias de tecidos tumorais, biópsias líquidas apresentam risco mínimo para a pessoa e podem ser facilmente repetidas ao longo do tempo para fins de diagnóstico, quantificação da doença e monitoramento do seu progresso.
O ctDNA e CTC estão presentes em níveis muito baixos, dado o seu elevado nível de sensibilidade, a PCR Digital é capaz de detectar com precisão e quantificar sequências raras na presença de alvos abundantes. Uma série de estudos têm mostrado que ddPCR pode ser utilizado com amostras de biópsia líquida, mais custo efetiva e muitas vezes com uma sensibilidade mais elevada do que outras técnicas.
Esta técnica é útil não só para a detecção de diferentes tipos de câncer, mas também pode ser utilizada para monitorizar alterações em um câncer, detectar a heterogeneidade do tumor, encontrar biomarcadores, e detectar a perda de resposta ao tratamento. A gama de doenças que pode ser detectada e rastreada por biópsia líquida está se expandindo rapidamente. Alguns exemplos incluem a detecção precoce de diabetes tipo 1, detecção e monitoramento de infecções, transplante de órgãos, e testes de gravidez não-invasivos.
Fonte: LabNetwork
